上海RNA

上海RNA操作步驟:

　　1. 勻漿處理:

　　a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀(yi) 進行勻漿處理。樣品體(ti) 積不應超過TRIzol體(ti) 積10℅。

　　b.單層培養(yang) 細胞 直接在培養(yang) 板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2麵積（即3.5cm直徑的培養(yang) 板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養(yang) 板麵積而定，不取決(jue) 於(yu) 細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA汙染。

　　c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反複吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀(yi) 處理。

　　上海RNA將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鍾，使核酸蛋白複合物*分離。

　　1．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於(yu) 2-8℃10000×g離心10分鍾，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

　　2. 2-8℃10000×g離心15分鍾。樣品分為(wei) 三層：底層為(wei) 黃色有機相，上層為(wei) 無色水相和一個(ge) 中間層。RNA主要在水相中，水相體(ti) 積約為(wei) 所用TRIzol試劑的60℅。

　. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾。

　　1. 2-8℃10000×g離心10分鍾，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側(ce) 和管底出現膠狀沉澱。移去上清。

　2. 用75℅乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鍾，棄上清。

　　3.室溫放置幹燥或真空抽幹RNA沉澱，大約晾5-10分鍾即可.不要真空離心幹燥，過於(yu) 幹燥會(hui) 導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鍾使RNA溶解.如RNA用於(yu) 酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。