RNAi的應用前景

RNAi的應用前景
 

 RNAi 技術中的相關(guan) 問題主要涉及以下幾點：
 
     （1） dsRNA 序列的選擇dsRNA 主要選自已知的cDNA 的開放閱讀框架（ORF） 中的基因區域。為(wei) 防止mRNA 調控蛋白對RISC 與(yu) 靶RNA 結合的幹擾,應避免選擇包括:1） 起始密碼子下遊或終止密碼的50～100 核苷酸位置以內(nei) 的區域;2） 5′或3′端的非翻譯區域;3） 內(nei) 含子區域。此外,序列選擇時也應避開多聚鳥苷酸序列區（ ≥3 個(ge) ） ,因為(wei) 這樣容易形成四聚體(ti) 結構, 抑製RNAi 作用。選擇與(yu) 靶mRNA 上序列互補的21～23 個(ge) 核苷酸長度的片段,以AA 開頭為(wei) 佳,因為(wei) 此法能簡化dsRNA 合成過程,降低成本,而且合成的dsRNA 能更好地抵抗RNA 酶的降解。另外,盡量使dsRNA 序列中的GC含量接近50 %（45 %～55 %*） ,高GC 含量能明顯降低基因沉默的效應。選擇前可以搜索BLAST數據庫,保證無其他與(yu) 靶基因同源的基因存在,避免引起對其他相似基因的沉默作用。並不是所有的mRNA 均對RNAi 敏感。為(wei) 確保靶基因表達的有效抑製,同時合成兩(liang) 個(ge) 或以上的針對同一基因的不同靶區域的dsRNA ;而且,標記dsRNA 正義(yi) 鏈的3′端對RNAi 現象並沒有影響,現有的實驗尚未發現mRNA 的二級結構對RNAi 有任何顯著的影響。目前,RNAi 技術主要以哺乳動物細胞為(wei) 對象研究其基因的功能。但> 30bp 的dsRNA 在哺乳動物細胞中會(hui) 引起幹擾素樣效應,導致非特異性反應。因而直接選用其下遊的產(chan) 物分子siRNA 來代替,達到基因研究的目的。
 
     （2） dsRNA 的導入方法不同的生物體(ti) 可以選擇不同的方法。簡單生物,如單細胞生物等,可選用電穿孔的方法; 較複雜生物可選用dsRNA 微注射入生殖細胞或早期胚胎,線蟲也能采用腸道或假體(ti) 腔注射的方法,與(yu) 微注射相比,RNAi 效率上並無顯著差別。還有浸泡法、工程菌喂養(yang) 法、磷酸鈣共沉澱法等。若使用的是化學法人工合成的siRNA（正義(yi) 鏈和反義(yi) 鏈） ,還要經過退火過程,以雙鏈的形式導入靶細胞。有人提出了以質粒或病毒為(wei) 載體(ti) ,通過轉導或轉染途徑,在細胞內(nei) 以DNA 為(wei) 模板,利用RNA 聚合酶Ⅲ,轉錄為(wei) siRNA（直接形成雙鏈或通過回文序列折疊後形成發夾結構） ,也能產(chan) 生較明顯的RNAi 效應。zui近,又有一種新的導入方法,就是借助高壓水槍的外力將構建的質粒直接自小鼠的尾靜脈注入體(ti) 內(nei) ,觀察RNAi 在活體(ti) 生物模型而不是培養(yang) 細胞上的基因沉默效應 ,但觀察到的siRNA 的半衰期較短,而且由於(yu) 使用了高壓的外力,過程較複雜,限製了其在人類疾病治療方麵的應用。而Pachuk 等則提出了肌注的方法,將針對IL－12 的siRNA 的質粒表達載體(ti) 導入小鼠體(ti) 內(nei) ,得到的RNAi 效應更持久。

 
     （3） 發夾樣結構的siRNA實驗證明,發夾樣siRNA 能延長在細胞內(nei) 的作用時間。此類結構可由具有回文序列的核苷酸鏈形成。但通常回文結構不易獲得,也可用頭碰頭的對稱序列來代替。轉錄發夾樣siRNA 的模板必須與(yu) 載體(ti) 轉錄啟動子緊密相連,而且盡可能有zui短的多聚腺苷酸尾巴,這樣才能誘導的RNAi 效應。Paddison 等提出類似的結構也可應用於(yu) 長片段dsRNA （500bp 左右） ,而不會(hui) 引起RNA 非特異性的降解。這為(wei) 檢測哺乳動物細胞中經過長期發育後的基因功能提供了新的途徑。

 

    RNAi 的應用領域及前景：RNAi 是一種的特異性強的基因阻斷技術,近年來發展迅速,很快就成為(wei) 功能基因組研究的有力工具。通過實驗手段將dsRNA 分子導入細胞內(nei) , 特異性地降解細胞內(nei) 與(yu) 其序列同源的mRNA ,封閉內(nei) 源性基因表達,從(cong) 反向遺傳(chuan) 的角度研究人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應用此項技術分離了果蠅胰島素信號轉導途徑通路中的各種成分。近來也有實驗報道通過RNAi 研究細胞內(nei) 脂質平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前,曾利用反義(yi) RNA 與(yu) 靶mRNA 序列互補的特性來抑製其表型的發生,但由於(yu) 反義(yi) RNA對內(nei) 源性表達的基因抑製作用較弱,往往會(hui) 產(chan) 生一些過渡表型,易造成對基因功能判斷錯誤,目前已通過審批認為(wei) 臨(lin) 床上具有治療作用的僅(jin) 有一種藥物———Vitravene 。RNAi 技術與(yu) 之相比,特異性更高,作用更迅速,副反應小,在有效地沉默靶基因的同時,對細胞本身的調控係統也沒有影響。zui近在人類體(ti) 細胞裏已經成功地對近20 種基因功能進行了“敲除”,尤其是因此而了解了人類空泡蛋白Tsg101 對HIV 在人體(ti) 內(nei) 增殖的作用,進一步深化了對HIV 的研究。Leonid 等以脊髓灰質炎病毒為(wei) 模型,利用RNAi 來誘導細胞的胞內(nei) 免疫,產(chan) 生抗病毒效應,尤其是針對RNA 病毒。對於(yu) 易突變的病毒,可設計多種靶向病毒基因保守序列的dsRNA ,減少它對dsRNA 的抵抗。Maen 等也應用RNAi 技術成功地阻斷了MCF－7 乳腺癌細胞中一種異常表達的與(yu) 細胞增殖分化相關(guan) 的核轉錄因子基因Sp21 的功能。RNAi 技術的應用,不僅(jin) 能大大推動人類後基因組計劃（蛋白組學） 的發展,還有可能設計出RNAi 芯片,高通量地篩選藥物靶基因,逐條檢測人類基因組的表達抑製情況來明確基因的功能,並且它還將應用於(yu) 基因治療、新藥開發、生物醫學研究等領域,用RNAi 技術來抑製基因的異常表達,為(wei) 治療癌症、遺傳(chuan) 病等疾病開辟了新的途徑。