TA克隆（TA-cloning）

    （TA-cloning）是利用Taq聚合酶的特性將PCR產(chan) 物克隆的方法，又稱為(wei) T-載體(ti) 克隆。

     在四種dNTP存在下可以向非特性的PCR產(chan) 物的3’末端特異性的添加一個(ge) A。這也成為(wei) Taq酶催化的PCR產(chan) 物不能的連接至平末端載體(ti) 的主要原因。相反地，如果此時有一個(ge) 線性的帶有粘性T末端的載體(ti) DNA（T載體(ti) ），那麽(me) 帶有A粘性末端的PCR產(chan) 物就可以的插入載體(ti) DNA中。這種方法被稱為(wei) TA克隆。

 

實驗材料：

Invitrogen公司提供的TOPO 快速TA 克隆試劑盒。我們(men) 采用pCR®II-TOPO®體(ti) 係。

內(nei) 含TOPO TACloning® reagents （Box 1） 和 One Shot® Chemically Competent cells （Box 2）.

TOPO 反應鹽溶液：200 mM NaCl,10 mM MgCl2。

 

實驗步驟：

 

總體(ti) 步驟：

PCR 反應

進行TOPO反應，連接PCR產(chan) 物與(yu) TOPO載體(ti)

用連接好的TOPO克隆轉化TOPO感受態細胞

藍白斑篩選

 

細節：

1、PCR 反應

按正常步驟用Taq聚合酶進行PCR反應循環。

 

2、進行TOPO反應，連接PCR產(chan) 物與(yu) TOPO載體(ti)

在反應體(ti) 係中加入如下反應物：

新鮮的PCR產(chan) 物1ul

TOPO反應鹽溶液 1ul

無菌水 4ul

TOPO® vector 1ul

共 6ul

輕輕混合以上反應物，在室溫（22oC-23oC）溫育5分鍾。

將以上反應物置於(yu) 冰上，進行轉化

 

3、用連接好的TOPO克隆轉化TOPO感受態細胞

向試劑盒提供的 One Shot® Chemically Competent E. coli中加入2ul以上反應液，輕輕混勻。在冰上進行轉染10分鍾。

在42oC下熱刺激細胞30秒，然後馬上轉移至冰上。

向體(ti) 係中加入250ul 室溫下的SOC 培養(yang) 液。

水平離心轉化管（200rpm, 37oC）1小時。

用10~50ul 轉化液向預熱的培養(yang) 基鋪板。

 

4、藍白斑篩選

取出10個(ge) 白色或淺藍色的菌落在含有50ug/ml卡那黴素或氨苄青黴素LB培養(yang) 基中培養(yang) 。

提純質粒，進行鑒定。

 

 

其中的T載體(ti) 可以用以下：

Ø 一種載體(ti) 可以用限製性內(nei) 切酶如XcmI, HphI, 與(yu) MobII 酶切消解產(chan) 生，3‘末端未配對的T。

Ø 應用末端轉移酶與(yu) 雙脫氧TTP加入一個(ge) 突出的T殘基到線形化載體(ti) 的3’末端。

Ø 應用不依賴末端的Taq DNA聚合酶的末端轉移酶活性在線形化載體(ti) 的3‘末端出的羥基基團上催化連接上一個(ge) T堿基。

 

    但是並非所有可用於(yu) PCR的耐熱DNA聚合酶都具有非模版依賴的A添加能力。例如常用於(yu) 高精度PCR反應的Pfu 聚合酶隻能產(chan) 生平末端，因而不能夠用於(yu) TA克隆。

 

     目前，T載體(ti) 可以從(cong) 許多供應商那裏購買(mai) 得到克隆化的試劑盒，如pCR-Script[SK+]（from Statagene 公司），PCRII的TA克隆試劑盒（from Invitrogen 公司），PGEM-T （from Promega 公司）等等。

 

    以下以PCRII的TA克隆試劑盒（from Invitrogen 公司）為(wei) 例講述 的過程：

    從(cong) 牛痘病毒（Vaccinia）中提取的DNA拓撲異構酶1可以識別5’-CCCTT序列，並連接5’-CCCTT和外源DNA（Shuman, 1991，1994），因而可用於(yu) TA cloning。

 

參考文獻：

1. Joseph Sambrook，David W Russell. Molecular cloning（3rd edition）

2. Shuman, S. （1991）.  Recombination Mediated by Vaccinia Virus DNA Topoisomerase I in Escherichia coli is Sequence Specific. Proc. Natl. Acad. Sci. 

3. Holton TA, Graham MW.  A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.  Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1156

4. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS.  Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1154.

5. Borovkov AY, Rivkin MI.  XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May;22（5）:812-4. 

6. Kovalic D, Kwak JH, Weisblum B.  General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction.  Nucleic Acids Res. 1991 Aug 25;19（16）:4560. 

7. Hengen PN.  Fidelity of DNA polymerases for PCR. Trends Biochem Sci. 1995 Aug;20（8）:324-5. 

8. Leal, J.F.M.; López-Barea, J.; Dorado, G.  T-vector cloning and high performance PCR with SuperTth from Thermus thermophilus  Genetic Analysis: Biomolecular Engineering Volume: 12, Issue: 2, October, 1995, pp. 119-121  

9. Hoover C, 1998 July 8. Invitrogen web catalog.  Accessed 1999 Feb 14.