淺析質粒與載體

 

一、


a複製起始位點Ori 即控製複製起始的位點。原核生物DNA分子中隻有一個(ge) 複製起始點。而真核生物DNA分子有多個(ge) 複製起始位點。
b 抗生素抗性基因 可以便於(yu) 加以檢測，如Amp+ ,Kan+
c 多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因段
d P/E 啟動子/增強子
e Terms 終止信號
f 加poly（A）信號 可以起到穩定mRNA作用


二、


*步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）
第二步：再看篩選標記，如抗性，決(jue) 定使用什麽(me) 篩選標記。
（1）Ampr 水解β－內(nei) 酰胺環，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四環素進入細胞。
（3）camr 生成氯黴素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉移酶 使G418（長那黴素衍生物）失活
（5）hygr 使潮黴素β失活。
第三步：看多克隆位點（MCS）。它具有多個(ge) 限製酶的單一切點。便於(yu) 外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會(hui) 導致某種標誌基因的失活，而便於(yu) 篩選。決(jue) 定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入段大小。質粒一般隻能容納小於(yu) 10Kb的外源DNA段。一般來說，外源DNA段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。
第五步：是否含有表達係統元件，即啟動子－核糖體(ti) 結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體(ti) 與(yu) 表達載體(ti) 。克隆載體(ti) 中加入一些與(yu) 表達調控有關(guan) 的元件即成為(wei) 表達載體(ti) 。選用那種載體(ti) ，還是要以實驗目的為(wei) 準繩。
啟動子－核糖體(ti) 結合位點－克隆位點－轉錄終止信號
a 啟動子－促進DNA轉錄的DNA順序，這個(ge) DNA區域常在基因或操縱子編碼順序的上遊，是DNA分子上可以與(yu) RNApol特異性結合並使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。
b增強子/沉默子－為(wei) 真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與(yu) 增強子所在的位置或方向無關(guan) 。即在所調控基因上遊或下遊均可發揮作用。/沉默子－負增強子，負調控序列。
c核糖體(ti) 結合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體(ti)
d 轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的zui後一個(ge) 外顯子中有一個(ge) AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐(feng) 區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。結構基因的zui後一個(ge) 外顯子中有一個(ge) AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐(feng) 區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。
 


三、


1. 載體(ti) 的概念
    載體(ti) 主要有病毒和非病毒兩(liang) 大類,即要把一個(ge) 有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體(ti) 細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體(ti) 細胞，這種運載工具就叫做載體(ti) （vector）。
P.S.基因工程所用的vector實際上是DNA分子，是用來攜帶目的基因段進入受體(ti) 細胞的DNA


2. 載體(ti) 的分類
按功能分成：

（1）克隆載體(ti) 都有一個(ge) 鬆弛的複製子，能帶動外源基因，在宿主細胞中複製擴增。它是用來克隆和擴增DNA段（基因）的載體(ti) 。（所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴(yan) 謹行載體(ti) ）
（2）表達載體(ti)  具有克隆載體(ti) 的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉錄/翻譯所必需的DNA順序的載體(ti) 。


按進入受體(ti) 細胞類型分：

（1）原核載體(ti)  

（2）真核載體(ti)  

（3）穿梭載體(ti) （sbuttle vector）指在兩(liang) 種宿主生物體(ti) 內(nei) 複製的載體(ti) 分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩(liang) 種生物之間）.

3. 基因工程載體(ti) 的特點：
（一）都能獨立自主的複製：載體(ti) DNA分子中有一段不影響它們(men) 擴增的非必需區域，如MCS，插在其中的外源DNA段，能被動的跟著載體(ti) 一起複製/擴增，就像載體(ti) 的正常成分一樣。
（二）都能便利的加以檢測：如載體(ti) 的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體(ti) 細胞放在含有該抗生素培養(yang) 板上培養(yang) 生長時，隻有攜帶這些抗性基因的載體(ti) 分子的受體(ti) 細胞才能存活。
（三）都能容易進入宿主細胞中去，也易從(cong) 宿主細胞中分離純化出來。


4. 載體(ti) 的選擇和製備：
選擇載體(ti) 主要依據構建的目的，同時要考慮載體(ti) 中應有合適的限製酶切位點。如果構建的目的是要表達一個(ge) 特定的基因，則要選擇合適的表達載體(ti) 。
載體(ti) 選擇主要考慮下述3點：
【1】構建DNA重組體(ti) 的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體(ti) /表達載體(ti) 。
【2】.載體(ti) 的類型：
（1）克隆載體(ti) 的克隆能力－據克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb選質粒。
（2）表達載體(ti) 據受體(ti) 細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體(ti) 。
（3）對原核表達載體(ti) 應該注意3點：
①選擇合適的啟動子及相應的受體(ti) 菌；
②用於(yu) 表達真核蛋白質時注意克服4個(ge) 困難和閱讀框錯位；
③表達天然蛋白質或融合蛋白作為(wei) 相應載體(ti) 的參考。
【3】載體(ti) MCS中的酶切位點數與(yu) 組成方向因載體(ti) 不同而異，適應目的基因與(yu) 載體(ti) 易於(yu) 鏈接，不產(chan) 生閱讀框架錯位。
選用質粒（zui常用）做載體(ti) 的4點要求：
①選分子量小的質粒，即小載體(ti) （1－1.5kb）→不易損壞，在細菌裏麵拷貝數也多（也有大載體(ti) ）；
②一般使用鬆弛型質粒在細菌裏擴增不受約束，一般10個(ge) 以上的拷貝，而嚴(yan) 謹型質粒<10個(ge) 。
③必需具備一個(ge) 以上的酶切位點，有選擇的餘(yu) 地；
④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。