淺談質粒載體的構建及類型

一、必須具備的基本條件

   現行通用的基因克隆載體(ti) ，絕大多數就是以質粒為(wei) 基礎改建而成的。一般說來，一種理想的用作克隆載體(ti) 的質粒必須滿足如下幾個(ge) 方麵的條件：
（1）具有複製起點

（2）具有抗菌素抗生基因

（3）具若幹限製酶單一識別位點

（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數 

二、的選擇記號

　　在基因克隆中采用的質粒載體(ti) 的選擇記號，包括有新陳代謝特性、對大腸杆菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。但絕大多靈敏的質粒載體(ti) 都是使用抗菌素抗性記號。基因克隆實驗中常用的幾種抗菌素的作用方式及其抗性機理列於(yu) 。

三、不同類型的

　（1）高拷貝數的質粒載體(ti)
　　適於(yu) 分離大量的高純度的克隆基因的DNA段。如ColE1、pMB1或它們(men) 的派生質粒。它們(men) 不僅(jin) 具有低分子量、高拷貝數的優(you) 點，而且在沒有蛋白質合成的條件下仍能繼續複製。因此，若在處於(yu) 對數生長晚期的含有ColE1一類質粒的大腸杆菌培養(yang) 物中，加入適量的蛋白質合成抑製劑講如氯黴素或壯觀黴素處理之後，每個(ge) 細胞中的質粒拷貝數則可擴增到1000～3000個(ge) 之多。如果加入高濃度的尿核苷，質粒DNA又可進一步擴增2～3倍。


　（2）低拷貝數的質粒載體(ti)
　　適合於(yu) 克隆含量過高對寄主代謝有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。這類質粒載體(ti) 的一個(ge) 普遍性問題是，由於(yu) 它們(men) 體(ti) 積小、拷貝數低，與(yu) 此相應的基因劑量也就較少，因此要製備大量的克隆DNA就很困難。


　（3）失控的質粒載體(ti)
　　失控的質粒載體(ti) （runaway plasmid vectors）：是一些低拷貝的質粒，其複製控製是溫度敏感型的，也就是說在不同的溫度下，拷貝數會(hui) 有顯著的變化。
　　B.E.Uhlin等人（1979）首先發展了失控的質粒載體(ti) pBEU1和Pbeu2。這種質粒載體(ti) 在30℃下，每個(ge) 寄主細胞中隻含有適量的拷貝數，而當培養(yang) 溫度超過35℃時，質粒的複製便失去了控製，每個(ge) 細胞中的拷貝數便持續上升。在這種高溫環境下，細胞的生長蛋白質的合成可按正常的速率持續2～3小時。這期間編碼在質粒載體(ti) 上的基因產(chan) 物便超過了常量。zui後，細胞生長受到了抑製，並失去了存活的能力，但在這個(ge) 階段質粒DNA可累積到占細胞總DNA的50%。


　（4）插入失活型的質粒載體(ti)
　　選用插入失活型質粒，將外源DNA段插入在會(hui) 導致選擇記號基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位點，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽性克隆的幾率。除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位點，因此都屬於(yu) 插入失活型的質粒載體(ti) 。


　（5）正選擇的質粒載體(ti)
　　正選擇質粒載體(ti) （direct selection vectors）：這種質粒載體(ti) 具有具有直接選擇記號並賦予寄主細胞相應的表型。通過選擇具這種表型特征的轉化子，便可大大降低需要篩選的轉化子的數量，從(cong) 而減輕了實驗的工作量，提高了選擇的敏感性。


　（6）表達型的質粒載體(ti)
　　使克隆在大腸杆菌中特定位點的外源真核基因的編碼序列置於(yu) 大腸杆菌的轉錄-轉譯信號控製之下，並能在大腸杆菌細胞中正常轉錄並轉譯成相應蛋白質的克隆載體(ti) 特稱為(wei) 表達載體(ti) （expression vectors）。它分為(wei) 表達型質粒載體(ti) 和表達型噬菌體(ti) 載體(ti) 兩(liang) 種不同的類型。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　      一種典型的大腸杆菌表達型質粒載體(ti) 的主要組成部分，包括大腸杆菌的啟動子及操縱全點序列、多克隆位點、轉錄及轉譯信號、質粒載體(ti) 的複製起點及抗菌素抗性基因

     那些沒有經過以基因克隆為(wei) 目標的體(ti) 外修飾改造的質粒被成為(wei) 天然質粒。在大腸杆菌中，常見的要用於(yu) 基因克隆的天然質粒有ColE1RSF2124和pSC101等。
　　鑒於(yu) 天然質粒用作基因克隆載體(ti) 存在著不同程度的局限性，所以科學工作者便在其基礎上進行了修飾改造，首先發展出了一批低分子量、高拷貝、多選擇記號的。