淺談基因的亞克隆

發布日期：2013-11-15 瀏覽次數：4513

：細胞克隆中，對培養(yang) 的細胞來說，從(cong) 原有的克隆中，再篩選出具有某種特性的細胞進行培養(yang) ，就是subclone，分為(wei) 細胞克隆和分子克隆。

一、

1、掌握細菌基因組提取的方法和原理。

2、掌握限製性核酸內(nei) 切酶處理基因組及其結果分析。

3、掌握基因片段回收的方法。

二、

細菌基因組的提取：通過堿法或者酶法裂解細菌之後，可以將胞內(nei) 的核酸和蛋白質全釋放出來。DNA溶於(yu) 1mol/L的NaCl中，不溶於(yu) 0.14mol/L的NaCl，而RNA溶於(yu) 0.14mol/L的NaCl不溶於(yu) 1mol/L的NaCl中，通過溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開。氯仿－異戊醇法除去蛋白，2倍體(ti) 積乙醇將DNA沉澱出來。

限製性核酸內(nei) 切酶隻作用於(yu) 特定的位點，處理基因組後隻會(hui) 得到有限的片斷。通過單酶切或者多酶切後電泳檢驗就可以得到與(yu) 物種本身有關(guan) 的特定的圖譜。

電泳後選定目的基因的條帶，紫外燈下將含有目的基因的凝膠切下，使用凝膠回收試劑盒，將凝膠溶化後，通過吸附柱時，核酸片段就吸附在柱上，洗脫液洗脫後加入2倍體(ti) 積乙醇，核酸沉澱，TE溶解沉澱，核酸片段得到回收。

三、試劑與(yu) 器材

1、試劑 E.coli JM109，牛肉膏，胰蛋白腖，NaCl，微量細菌基因組抽提試劑盒（上海生工），BamH I、Xho1 核酸內(nei) 切酶（Takara），NEB 標準分子量片段（1kb DNA Ladder），凝膠電泳回收試劑盒

2、器材高速台式冷凍離心機，水平電泳儀(yi) ，漩渦混合儀(yi) ，紫外檢測儀(yi) ，凝膠成像分析係統，微量移液器及吸頭。

四、操作方法

1．使用LB培養(yang) 基活化、培養(yang) 菌體(ti) 。

2．離心收集菌體(ti) ，根據試劑盒說明提取基因組。

3．限製性酶處理基因組。

4．E.coli JM109的基因組經過限製性內(nei) 切酶處理後，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像係統將酶切圖譜采集下來並對其分析。

5．紫外燈下將需要回收的核酸片段切下來，使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

6．電泳檢測回收的核酸片段。