關於蛋白質提取與純化

    微生物生產(chan) 的蛋白質或酶有來自胞內(nei) 、來自細胞周質或被分泌到培養(yang) 介質中。對胞外酶而言，當zui後產(chan) 品是用於(yu) 工業(ye) 用途而不是需要太高純度時，純化工藝比較簡單。許多酶是以更為(wei) 複雜的胞內(nei) 混合物的形式存在，這對蛋白質純化研究人員提出更多的挑戰。

    正常來說，大部分蛋白質都可溶於(yu) 水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數與(yu) 脂類結合的蛋白質則溶於(yu) 乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。

    （1）水溶液提取法：稀鹽和緩衝(chong) 係統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質zui常用的溶劑，通常用量是原材料體(ti) 積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於(yu) 蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方麵，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於(yu) 溶解，縮短提取時間。但另一方麵，溫度升高會(hui) 使蛋白質變性失活，因此，基於(yu) 這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為(wei) 了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑製劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。


A、pH值
    蛋白質，酶是具有等電點的兩(liang) 性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩(liang) 側(ce) 的pH範圍內(nei) 。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發生變化，從(cong) 而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。


B、鹽濃度
    稀濃度可促進蛋白質的溶解，稱為(wei) 鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與(yu) 蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優(you) 點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為(wei) 宜。緩衝(chong) 液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

 

   （2）有機溶劑提取法：一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側(ce) 鏈較多的蛋白質和酶，不溶於(yu) 水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們(men) 具的一定的親(qin) 水性，還有較強的親(qin) 脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與(yu) 脂質結合緊密的蛋白質和酶特別*，一是因為(wei) 丁醇親(qin) 脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親(qin) 水性，在溶解度範圍內(nei) （度為(wei) 10%，40度為(wei) 6.6%）不會(hui) 引起酶的變性失活。

 另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇範圍較廣，也適用於(yu) 動植物及微生物材料。

 

親(qin) 和層析法： 

    親(qin) 和層析的原理與(yu) *的抗原一抗體(ti) 、激素一受體(ti) 和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親(qin) 和力。正如在酶與(yu) 底物的反應中，特異的廢物（S'）才能和一定的酶（E）結合，產(chan) 生複合物（E－S'）一樣。在親(qin) 和層析中是特異的配體(ti) 才能和一定的生命大分子之間具有親(qin) 和力，並產(chan) 生複合物。而親(qin) 和層析與(yu) 酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體(ti) （類似底物）是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親(qin) 和層析是把具有識別能力的配體(ti) L（對酶的配體(ti) 可以是類似底物、抑製劑或輔基等）以共價(jia) 鍵的方式固化到含有活化基團的基質M（如活化瓊脂糖等）上，製成親(qin) 和吸附劑M－L，或者叫做固相載體(ti) 。而固化後的配體(ti) 仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體(ti) 裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體(ti) 積）後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體(ti) 有親(qin) 和力的物質S就可借助靜電引力、範德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體(ti) 上，而無親(qin) 和力或非特異吸附的物質則被起始緩衝(chong) 液洗滌出來，並形成了*個(ge) 層析峰。

    然後，恰當地改變起始緩衝(chong)  液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從(cong) 固相載體(ti) 上解離下來，並形成了第M個(ge) 層析峰（見圖6－2）。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與(yu) 雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩(liang) 個(ge) 以上的物質與(yu) 固相載體(ti) 具有親(qin) 和力（其大小有差異）時，采用選擇性緩衝(chong) 液進行洗脫，也可以將它們(men) 分離開。用過的固相載體(ti) 經再生處理後，可以重複使用。

一）原理

    親(qin) 和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體(ti) ）和相應的抗體(ti) （或抗原）發生特異性結合，而這種結合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體(ti) ）固相化後，就可以使存在液相中的相應抗體(ti) （或抗原）選擇性地結合在固相載體(ti) 上，借以與(yu) 液相中的其他蛋白質分開，達到分離提純的目的。親(qin) 和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為(wei) 有效的方法，它經常隻需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從(cong) 很複雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與(yu) 另一種稱為(wei) 配體(ti) （Ligand）的分子能特異而非共價(jia) 地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以複雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從(cong) 複雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往采取幾種方法聯合使用。

    此法具有、快速、簡便等優(you) 點。

二）載體(ti) 的基本要求和選擇

理想的載體(ti) 應具有下列基本條件：①不溶於(yu) 水，但高度親(qin) 水；②惰性物質，非特異性吸附少；③具有相當量的化學基團可供活化；④理化性質穩定；⑤機械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，為(wei) 多孔的網狀結構，使大分子能自由通過；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

    可以做為(wei) 固相載體(ti) 的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、澱粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體(ti) 中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強。聚丙稀酰胺凝膠是目前的優(you) 良載體(ti) 。

    瓊脂糖凝膠的優(you) 點是親(qin) 水性強，理化性質穩定，不受細菌和酶的作用，具有疏鬆的網狀結構，在緩衝(chong) 液離子濃度大於(yu) 0.05Mol/L時，對蛋白質幾乎沒有非特異性吸附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化，活化後性質穩定，能經受層析的各種條件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl處理2h-3h及蛋白質變性劑7Mol/L尿素或6Mol/L鹽酸胍處理，不引起性質改變，故易於(yu) 再生和反複使用。

    瓊脂糖凝膠微球的商品名為(wei) Sepharose，含糖濃度為(wei) 2%、4%、6%時分別稱為(wei) 2B、4B、6B。因為(wei) Sepharose 4B的結構比6B疏鬆，而吸附容量比2B大，所以4B應用zui廣。

三）試劑與(yu) 配製

    1．Sepharose 4B

    2．CNBr

    3．抗原或抗體(ti)

    4．1Mol/L NaHCO3  取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

    5．0.1Mol/L NaHCO3

    6．2Mol/L NaOH

    7．0.01Mol/L pH7.4 PBS

       0.2Mol/L Na2HPO4   38.0ml

       0.2Mol/L Na2HPO4  162.0ml

       NaCl      32.76g

    加水至4 000ml。

    8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩衝(chong) 液  甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

    9．7Mol/L尿素

    10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）

       1Mol/L NaHCO3  100.00ml

              NaCl     2.93g

       加水至500.00ml。

四）實驗方法

    1．瓊脂糖活化

    ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏鬥中抽幹，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌，立即轉入100ml燒杯中，冰浴置於(yu) 磁力攪拌器上。

    ⑵ 在通風櫥內(nei) 稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然後倒入瓊脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反應10min。在1min~2min迅速調整pH為(wei) 8.0～11.0維持10min。

    ⑶ 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏鬥中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

2．偶聯蛋白  20ml 4B液體(ti) 相當於(yu) 一半的固相載體(ti) 。

⑴ 事先將需偶聯的抗原（或抗體(ti) ）蛋白200mg置於(yu) 0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數小時（一般偶聯量為(wei) 10~30mg/g載體(ti) ）。

⑵ 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min內(nei) ，從(cong) 抽洗到偶聯），4℃緩慢攪拌一晚，使蛋白與(yu) 活化的瓊脂結合。

3．裝柱

    ⑴ 選柱：不宜過大，一般以1.5×15cm的層析柱可裝偶聯蛋白的瓊脂糖約30ml。

    ⑵ 裝柱：將已與(yu) 蛋白偶聯的瓊脂糖裝入層析柱內(nei) ，擰緊下口夾，讓其下沉，數分鍾後鬆開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。

    ⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗滌至洗出液的OD280＜0.02為(wei) 止。

收集全部的洗脫液，測得的OD280值×洗脫液的總ml數即為(wei) 未偶聯蛋白的含量，由此可計算偶聯率。

 4．吸附與(yu) 解吸附

    ⑴按床體(ti) 積1/10加樣，濃度為(wei) 1％～2%，緩慢加入待純化的抗體(ti) （或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為(wei) 1ml/min，至洗出液OD280＜0.02為(wei) 止。

    ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl緩衝(chong) 液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白變性。

5．以兩(liang) 倍體(ti) 積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡後，可繼續使用。保存可加入0.02%Na N3於(yu) 4℃保存。防止冷凍和幹裂。

6．結果判定

    ⑴ 對解吸附下來的蛋白以圓盤電泳或雙相瓊脂糖電泳進行純度鑒定。

    ⑵ 將純度好的各管洗脫液合並，以生理鹽水透析，然後濃縮或凍幹保存。

       的製備工作涉及物理、化學和生物等各方麵知識，但基本原理不外乎兩(liang) 方麵。一是得用混合物中幾個(ge) 組分分配率的差別，把它們(men) 分配到可用機械方法分離的兩(liang) 個(ge) 或幾個(ge) 物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置於(yu) 單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配於(yu) 來同區域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質生物活性的喪(sang) 失。