第五章 蛋白電泳

                                     第五章 蛋白電泳




5.1  SDS-PAGE 基本原理

1. SDS-PAGE 是在蛋白質樣品中加入 SDS 和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS 是一種很強的陰離子表麵活性劑，它可以斷開分子內(nei) 和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構。

2.  強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構。使蛋白質分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚後的側(ce) 鏈與(yu)  SDS 充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 複合物。

3.  蛋白質分子結合 SDS 陰離子後，所帶負電荷的量遠遠超過了它原有的淨電荷，從(cong) 而消除了不同種蛋白質之間所帶淨電荷的差異。蛋白質的電泳遷移率主要決(jue) 定於(yu) 亞(ya) 基的相對分子質量，而與(yu) 其所帶電荷的性質無關(guan) 。

5.2  PAGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體(ti) 丙烯酰胺（acrylamide，簡稱Acr）和交聯劑（crosslinker)N,N’-亞(ya) 甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱 Bis）在催化劑（過硫酸胺或核黃素 AP）和加速劑（四甲基乙二胺 TEMED）作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠。化學惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質。聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧遊離基（free radicals）的催化，使體(ti) 係發生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來完成的。催化體(ti) 係主要有化學催化（AP-TEMED）和光化學催化（核黃素-TMTED）體(ti) 係。

                                      

5.3 聚丙烯酰胺凝膠分類

   PAGE 分為(wei) 連續係統和不連續係統兩(liang) 大類。連續係統電泳體(ti) 係中緩衝(chong) 液 pH 值與(yu) 凝膠中的相同。帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續係統中帶電顆粒在電場中泳動不僅(jin) 有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。

                                         

不連續係統的濃縮效應：

凝膠層的不連續性：濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小。在電場的作用下，蛋白質顆粒在大孔膠中遇到的阻力小，移動快。而在小孔膠中遇到的阻力大，移動慢。因此，在兩(liang) 層凝膠的交界處，由於(yu) 凝膠孔徑的不連續性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。緩衝(chong) 液離子成分和pH的不連續性：HCl易解離出Cl-，它在電場中遷移率大，走在zui前麵，故稱為(wei) 快離子或前導離子。電極緩衝(chong) 液中的甘氨酸在pH6.8 的緩衝(chong) 液中解離度很小，僅(jin) 為(wei)  0.1-1%，因而在電場中遷移率很小，稱為(wei) 慢離子或尾隨離子。蛋白質均帶負電荷，在電場中均移向正極，其有效遷移率介於(yu) 快慢離 子之間，於(yu) 是蛋白質就在快慢離子間形成的界麵處，被濃縮成極窄的區帶。當進入pH8.8的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質，因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界麵繼續前進。蛋白質分子由於(yu) 分子量大，被留在後麵，然後分離成多個(ge) 區帶。