上海基屹為您解析RNAi抗幹擾檢測

上海基屹為(wei) 您解析RNAi抗幹擾檢測

一．RNAi的發現
 
     早在1990 年進行轉基因植物有關(guan) 研究時偶然發現,將全長或部分基因導入植物細胞後某些內(nei) 源性基因不能表達,但這些基因的轉錄並無任何影響,並將這種現象稱為(wei) 基因轉錄後沉默（posttranscriptional gene silencing ,PTGS） . 1996 年在脈孢菌屬（Neurospora） 中發現了相似現象,隻不過將這種現象命名為(wei) 基因表達的阻抑作用（quelling） . 發現dsRNA 能夠導致基因沉默的線索來源於(yu) 線蟲Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃爾大學的研究人員Guo 和Kemphues 嚐試用反義(yi) RNA 去阻斷par－1 基因的表達以探討該基因的功能,結果反義(yi) RNA 的確能夠阻斷par21基因的表達,但是奇怪的是,注入正義(yi) 鏈RNA 作為(wei) 對照,也同樣阻斷了基因的表達。這個(ge) 奇怪的現象直到3年後才被解開——華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire 和馬薩諸塞大學癌症中心的Craig Mello 將雙鏈dsRNA ——正義(yi) 鏈和反義(yi) 鏈的混合物注入線蟲,結果誘發了比單獨注射正義(yi) 鏈或者反義(yi) 鏈都要強得多的基因沉默。實際上每個(ge) 細胞隻要很少幾個(ge) 分子的雙鏈RNA 已經足夠*阻斷同源基因的表達。後來的實驗表明在線蟲中注入雙鏈RNA 不單可以阻斷整個(ge) 線蟲的同源基因表達,還會(hui) 導致其*代子代的同源基因沉默。他們(men) 將這種現象稱為(wei) RNA 幹擾。
 
     過去認為(wei) , 哺乳動物細胞中不存在RNAi 現象,因為(wei) 較長的dsRNA 在哺乳動物細胞中能誘導IFN（幹擾素） 生成,並激活STAT 途徑參與(yu) 的PKR（dsRNA 依賴性激酶） 的轉錄,同時dsRNA 本身與(yu) PKR 結合也能令其激活,繼而磷酸化翻譯起始因子eIF2a 使之失活,導致非特異性的蛋白質合成障礙;另一方麵,dsRNA 又能誘導細胞產(chan) 生多種抗病毒蛋白的2′,5′腺苷合成酶,生成   2′,5′腺苷酸,激活非特異性的RNA 酶L ,發生非特異性的RNA 降解效應。現在發現, 隻要dsRNA 短於(yu) 30bp ,就不會(hui) 促發幹擾素效應,同時又能特異性地降解mRNA ,引起基因沉默,說明dsRNA 在哺乳動物細胞中也能發揮一定作用,為(wei) 以後的基因治療等RNAi 應用領域提供了新的研究方向。 
 
二．RNAi的作用機製
 
     近年來研究發現,幹擾性小RNA（ small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA） 是RNA 幹擾作用（RNAi） 賴以發生的重要中間效應分子. siRNA 是一類長約21～25 個(ge) 核苷酸（ nt ） 的特殊雙鏈RNA（dsRNA） 分子,具有特征性結構,即siRNA 的序列與(yu) 所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 兩(liang) 條單鏈末端為(wei) 5′端磷酸和3′端羥基. 此外,每條單鏈的3′端均有2～3 個(ge) 突出的非配對的堿基RNAi 的主要過程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的幹擾性小RNA （ siRNA） ,由siRNA 介導識別並靶向切割同源性靶mRNA 分子. 細胞中dsRNA的形成是RNAi 的*步. 細胞中dsRNA 可通過多種途徑形成,如基因組中DNA 反向重複序列的轉錄產(chan) 物;同時轉錄反義(yi) 和正義(yi) RNA ;病毒RNA 複製中間體(ti) ;以及以細胞中單鏈RNA 為(wei) 模板由細胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶（RdRp） 催化合成dsRNA等. 在線蟲（ C. elegans） 可以直接注射dsRNA 或把線蟲浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,還可以通過喂養(yang) 表達正義(yi) 和反義(yi) RNA 的細菌獲得dsRNA。
 
     現已初步闡明RNAi 的作用機製. RNAi 的*步是,dsRNA 在內(nei) 切核酸酶（一種具有RNase Ⅲ樣活性的核酸酶） 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正義(yi) 和反義(yi) 序列組成的幹擾性小dsRNA ,即siRNA.果蠅中RNase III 樣核酸酶稱為(wei) Dicer. Dicer 含有解旋酶（helicase） 活性以及dsRNA 結合域和PAZ 結構域. 已發現在Arabidopsis , C. elegans , Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳動物中也存在Dicer 同類物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反義(yi) 鏈指導形成一種核蛋白體(ti) ,該核蛋白體(ti) 稱為(wei) RNA 誘導的沉默複合體(ti) （ RNA induced silencing complex , RISC） , 由RISC 介導切割靶mRNA 分子中與(yu) siRNA 反義(yi) 鏈互補的區域,從(cong) 而達到幹擾基因表達作用. RISC 由多種蛋白成分組成,包括內(nei) 切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 鏈搜索活性等. 線蟲C. elegans中的MUT7（一種RNase D樣蛋白） 可能是一種3′5′外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成員可能是RISC中的構成組分,如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Crassa 中的QDE; C. elegans 中的RDE1 等,以上這些蛋白與(yu) 翻譯因子eIF2C 同源。
 
     的研究進一步揭示,ATP 在siRNA 介導的RNAi 中具有重要作用. 較長dsRNA 向siRNA 的轉變要有ATP 參與(yu) . siRNA 與(yu) 蛋白因子形成一個(ge) 無活性的約360 kD 的蛋白PRNA 複合體(ti) ;隨之, siRNA雙鏈結構解旋並形成有活性的蛋白PRNA 複合體(ti) （RISC） ,此步具有ATP 依賴性. RISC 活性複合體(ti) 對靶mRNA 的識別和切割作用,這一步可能不需ATP參與(yu) 。
 
     此外,ATP 使siRNA 5′端帶上磷酸分子,且對siRNA 的功能具有重要作用. 上述過程中siRNA 雙鏈結構解旋很可能是一種穩定的結構改變,因為(wei) siRNA 雙鏈體(ti) 與(yu) 細胞裂解物、ATP 等孵育後再除去ATP 及其它輔助因子,含有siRNA 的活性複合體(ti) 仍能識別和切割靶mRNA 分子。
 
     siRNA 可作為(wei) 一種特殊引物,在RNA 依賴RNA聚合酶（RdRp） 作用下以靶mRNA 為(wei) 模板合成dsRNA ,後者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可進入上述循環. 這種過程稱為(wei) 隨機降解性多聚酶鏈反應（random degradative PCR） . 新生的dsRNA 反複合成和降解,不斷產(chan) 生新的siRNA ,從(cong) 而使靶mRNA 漸進性減少,呈現基因沉默現象. RdRp 一般隻對所表達的靶mRNA 發揮作用,這種在RNAi 過程中對靶mRNA 的特異性擴增作用有助於(yu) 增強RNAi的特異性基因監視功能. 每個(ge) 細胞隻需要少量dsRNA 即能*關(guan) 閉相應基因表達,可見RNAi 過程具有生物催化反應的基本動力學特征。
 
     miRNA 與(yu) siRNA 的區別：
 miRNA是單鏈的，而siRNA則是雙鏈的；
miRNA參與(yu) 正常情況下生長發育基因調控，而siRNA不參與(yu) 動物體(ti) 的正常生長，隻有在病毒或其它dsRNA誘導情況下才產(chan) 生siRNA,作為(wei) miRNA的完善和補充；
 miRNA在轉錄後水平調節基因表達，推測在翻譯水平也起作用，而siRNA為(wei) 轉錄後水平調節基因表達調控；
Dicer酶對兩(liang) 類RNA的加工過程，miRNA為(wei) 不對稱性，僅(jin) 來自含莖－環結構RNA前體(ti) 的一側(ce) 臂，剩餘(yu) 部分很快降解，而這種不對稱性不存在於(yu) 而siRNA加工過程中。