實時定量PCR的原理、探測化學物質及探針優化

                         上海基屹生物闡述實時定量PCR的原理及探測化學物質

 

實時定量PCR原理

    對擴增產(chan) 物進行可重複性的定量長期以來一直是科學家和研究者的目標。傳(chuan) 統的方法需要對終產(chan) 物進行凝膠電泳分析。這種方法可以確定目的產(chan) 物和競爭(zheng) 產(chan) 物的大小，估算純度，計算條帶強度。然而，所用擴增試劑和體(ti) 係的變動會(hui) 造成擴增的終產(chan) 物的重複性有較大的變動，成為(wei) 這種方法的主要弊端。擴增過程的指數期提供給我們(men) zui有用的，可重複的數據。在起始的目的DNA量與(yu) 循環過程的指數期的擴增產(chan) 物量之間存在著定量關(guan) 係。這正是實時擴增的基礎。隨著DNA內(nei) 嵌染料和探針特異性化學的發展，實時探測量子學的跳躍發展推動了對擴增過程的研究進展。

    今天的實時設備由熒光讀數計和熱循環儀(yi) 組成，用來監測循環過程的熒光。與(yu) 實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數據被繪製成熒光強度相對於(yu) 循環數的圖表。在擴增的每個(ge) 循環中至少收集一次熒光數據來進行擴增的實時監控。用戶能夠根據一個(ge) 一個(ge) 的循環知道那個(ge) 樣品正在擴增。這些即時的數據允許用戶看清楚各個(ge) 樣本相對於(yu) 標準品，陽性對照和陰性對照是如何擴增的。用戶不僅(jin) 能在擴增過程中監督整個(ge) 反應，還可以根據反饋的信息來優(you) 化相應程序。因此增加了敏感性，特異性和有效性。

    正常化後的數據畫成熒光值相對於(yu) 循環數的對數圖。原始數據收集後可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化後可以設定域值水平，這就是分析熒光數據的水平。樣品到達域值水平所經曆的循環數稱為(wei) Ct值（限製點的循環數）。域值應設定在使指數期的擴增效率為(wei) zui大，這樣可以獲得zui準確，可重複性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產(chan) 生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。


探測化學物質

有5種主要類型的探測化學物質用於(yu) 實時擴增，包括： 
1 內(nei) 嵌染料 
2 雙標記探針 
3 FRET探針 
4 分子信標 
5 Ampliflor

1內(nei) 嵌染料（Sybr-Green I ）

內(nei) 嵌染料，例如Sybr-Green I ，能與(yu) 雙鏈DNA結合 
a） SG不與(yu) 單鏈DNA結合，熒光信號強度較低 
b） SG與(yu) 雙鏈DNA結合，熒光信號強度極大的增強

SG是一種熒光染料，能結合到DNA雙螺旋的小溝。處於(yu) 溶解狀態的未結合染料顯示低的熒光強度，一旦結合到雙鏈DNA之後熒光信號增強。這種特性被利用在實時擴增中。由於(yu) 在擴增反應中DNA增加，染料結合到擴增產(chan) 物上，熒光信號增強。熒光信號相對背景水平的增加進行分析。根據擴增子的長度有多個(ge) 熒光染料的分子結合到雙鏈DNA上。內(nei) 嵌染料可以所有其他傳(chuan) 統擴增成分，例如水，緩衝(chong) 液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到擴增反應管中。因為(wei) 不需要設計序列特異性探針和新的引物對，這種方法是一種簡便 ，性價(jia) 比較高的實時監測方法。

內(nei) 嵌染料沒有序列特異性，可以結合到包括非特異產(chan) 物和引物二聚體(ti) 在內(nei) 的任何dsDNA上，因此有必要區分目標信號和假信號。內(nei) 嵌染料可以在反應末尾對擴增產(chan) 物進行溶解，稱為(wei) 溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從(cong) 低於(yu) 產(chan) 物溶解點緩慢升到高於(yu) 產(chan) 物溶解點，實時儀(yi) 器連續監測每個(ge) 樣品的熒光值。基於(yu) 產(chan) 物長度和G/C含量的不同，擴增產(chan) 物會(hui) 在不同的溫度點解鏈。隨著產(chan) 物的解鏈，可以看到熒光值的降低並被儀(yi) 器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。


溶解峰反映了反應中擴增到的產(chan) 物。這些峰是凝膠電泳中條帶的類似物。因此，用溶解曲線數據對SG反應後的產(chan) 物進行質量監督。

2 雙標記探針

雙標記探針是一種短的寡核苷酸序列，5‘末端連接有熒光報告染料，3‘端連接有熒光淬滅分子。由於(yu) 這種探針隻有15-25bp長，報告基團和淬滅基團緊密接近，幾乎探測不到熒光信號。在循環過程中，Taq DNA聚合酶對每個(ge) 引物進行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸過程中會(hui) 切除下遊的探針。一旦探針被降解，報告染料就會(hui) 與(yu) 淬滅分子相分離。 
a） 報告染料R發射的能量被淬滅分子Q所吸收和淬滅。 
b） 聚合酶的外切核酸酶活性通過水解方式將報告染料與(yu) 淬滅分子相分離導致了熒光信號的增加。

在每個(ge) 擴增循環由於(yu) 切開了探針因此實時設備探測到報告染料的增加。由於(yu) 報告染料被切開，因此不能進行溶解曲線分析。雙標記探針比內(nei) 嵌染料有更高的特異性，這裏有2個(ge) 原因 ：
  首先，雙標記探針具有序列特異性，隻結合到互補區。

  第二個(ge) 原因是雙標記探針對每擴增的一個(ge) 拷貝隻釋放一個(ge) 分子的熒光染料。由於(yu) 雙標記探針增加了特異性，這種探測方法很適合檢測低拷貝數的模板。


3．FRET 探針

FRET 
探針依靠熒光能量從(cong) 一個(ge) 熒光染料到另一個(ge) 的傳(chuan) 遞。兩(liang) 個(ge) 獨立的特異寡核苷酸序列都標記上熒光基團。上遊探針在3‘末端有一個(ge) 供體(ti) 基團，下遊探針在5‘末有一受體(ti) 基團。設計探針時他們(men) 在與(yu) 目標序列結合時互相臨(lin) 近，使供體(ti) 和受體(ti) 熒光基團緊密接近。一旦探針雜交到模板上，從(cong) 供體(ti) 到受體(ti) 熒光基團的能量傳(chuan) 遞產(chan) 生了一個(ge) 不同波長的熒光信號。供體(ti) 熒光信號的減弱和受體(ti) 熒光信號的加強都能分別監測到。因此，隻有當兩(liang) 個(ge) 探針都結合上去才能檢測到熒光信號。FRET 
探針可以進行溶解曲線分析，對基因型分析，SNP檢測和其他突變檢測非常有用。

a） 擴增循環中，兩(liang) 個(ge) 探針與(yu) 靶DNA退火 
b） 供體(ti) 被外部光源激發通過能量傳(chuan) 遞導致發射熒光的產(chan) 生。

4 分子信標

第四種檢測方法是分子信標（MB）。這種探針的基本特征是有一個(ge) 發夾結構，在此結構的一個(ge) 末端有一個(ge) 熒光染料報告基團，在另一個(ge) 末端有一個(ge) 淬滅分子。 
這個(ge) 發夾結構能使MB探針在不雜交時保持折疊狀態，報告基團和淬滅分子處於(yu) 接近的距離，幾乎沒有熒光信號發出。然而，當MB與(yu) 模板雜交時，發夾結構被破壞，發色團不會(hui) 被淬滅。在這個(ge) 時間點，實時儀(yi) 器能探測到熒光信號。用MB探針也可以進行溶解曲線分析。

a） 分子信標的發夾結構淬滅了熒光信號 
b） 雜交後開始發射熒光信號

得益於(yu) 實時探測技術的實際應用數量和應用類型影響深遠。其中的一些益處包括有機體(ti) 的鑒定，診斷性檢測，基因表達研究，突變檢測，SNP檢測，基因型和微陣列結果確證等。每種不同的化學物質根據應用的不同會(hui) 提供給用戶不同的便利。應該注意的是，得益於(yu) 實時測技術並建立在熒光化學物質基礎上的還有其他檢測核酸的等溫擴增係統。

5 AmplifluorTM直直接基因係統

AmplifluorTM直直接基因係統基本特征是激發的熒光進行分子能量轉移到受體(ti) 成分導致熒光發射的淬滅。目標特異性AmplifluorTM直引物包含一個(ge) 5‘內(nei) 部互補序列，標記有熒光發色（fluorescerin）和一個(ge) 能量受體(ti) ：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。發夾結構的3‘端序列是目標特異性引物區。未結合的AmplifluorTM直引物由於(yu) 內(nei) 部熒光發色團和淬滅分子的緊密接近，隻有低的熒光信號。

在*個(ge) 循環中，Amplifluor引物1與(yu) 特異CDNA的*條鏈退火並被Taq酶延伸。在 第二個(ge) 循環中 
Amplifluor引物1延伸產(chan) 物作為(wei) 引物2（反義(yi) 鏈引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor發夾引物解折疊並產(chan) 生熒光信號。隨後的擴增循環中產(chan) 生的熒光信號的增強與(yu) 擴增產(chan) 物量的增加成比例。