siRNA幹擾檢測服務

siRNA幹擾檢測服務

原理：RNA幹擾 (RNA interference, RNAi)技術，是將與(yu) 內(nei) 源mRNA 編碼區同源的小片段(19 -23bp)外源雙鏈 RNA(siRNA)導入細胞中，引發細胞中相應mRNA 高效特異性降解，從(cong) 而導致特定基因表達沉默(knock down)的一種實驗技術，其中通過構建表達載體(ti) 表達siRNA是多種siRNA製備方法中*有可能進行長期基因沉默研究的方法，siRNA 載體(ti) 可以在細胞內(nei) 直接轉錄出shrna ，其幹擾效果等同於(yu) siRNA ，而且能夠解決(jue) siRNA幹擾時間短的缺點。您隻需提供需幹擾基因的詳細信息，包括基因的 mRNA 序列，Genbank Accession No. 和所屬物種，本公司負責設計3條針對目的mRNA的siRNA 靶序列，在短時間內(nei) 構建三個(ge) 可用於(yu) 目的mRNA幹擾實驗的siRNA 載體(ti) 並為(wei) 您進行後續的幹擾實驗研究。

實驗流程

◇ 選擇siRNA表達載體(ti) 通過人工合成基因的方法將該序列克隆至Clontech公司的RNAi-Ready pSIREN係列表達載體(ti) 中，該係列表達載體(ti) 帶有Pol III(U6)啟動子，具有轉染效率高、操作簡單、rna沉默效果易於(yu) 檢測等特點，客戶可根據需要進行選擇。

◇ 設計siRNA靶序列

◇ 根據客戶提交的目的mRNA序列，設計3條RNA幹擾靶序列，靶序列一般為(wei) 19-21nt 長。

◇ 對於(yu) 每條選定的siRNA 靶序列，設計 siRNA 正義(yi) 鏈和反義(yi) 鏈，以 loop(9nt or 10nt) 相連，形成穩定的發卡RNA，稱為(wei) shRNA(short hairpin RNA)。

◇ 合成模板 合成每條編碼 shRNA的DNA 模板，並連接到 siRNA 載體(ti) 相應的多克隆位點之間。連接產(chan) 物轉化DH5α大腸杆菌。

◇ 抽提陽性克隆質粒 公司試劑盒抽提陽性克隆載體(ti) 並定量。

◇ 轉染細胞 質粒直接轉染或通過病毒包裝後轉染細胞，並對轉染細胞進行陽性鑒定和轉代細胞株的培養(yang) 。

◇ 幹擾效果檢測

◇ 基因水平上檢測 提取RNA、反轉錄、Realtime PCR檢測幹擾效果(客戶自備細胞係)。

◇ 蛋白水平上檢測 Western Blot檢測蛋白水平幹擾效果(客戶自備一抗)。

服務周期及價(jia) 格

服務說明

◇ siRNA服務需客戶與(yu) 我們(men) 共同討論實驗方案，並提供靶基因名稱、序列或GeneBank ID和希望插入載體(ti) 的名稱等，免費為(wei) 您設計siRNA序列。

◇ 由於(yu) 構建的siRNA表達載體(ti) 中插入的片段可以形成hairpin結構，因此可能會(hui) 影響測序。如果我們(men) 對質粒測序結果不理想時，將對由質粒擴增得到的PCR產(chan) 物進行測序。

◇ 開始實驗時公司和客戶簽訂詳細的實驗技術服務合同、保密合同，客戶需預付合同金額的50%作為(wei) 預付款。

提供結果

實驗報告包括：siRNA序列、構建載體(ti) 的測序報告、熒光定量PCR檢測報告、Western Blot圖片及全部實驗數據和詳細的實驗步驟。