淺析慢病毒載體

    慢病毒載體(ti) （ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基礎上改造而成的病毒載體(ti) 係統，它能的將目的基因（或 RNAi ）導入動物和人的原代細胞或細胞係。慢病毒載體(ti) 基因組是正鏈 RNA ，其基因組進入細胞後，在細胞漿中被其自身攜帶的反轉錄酶反轉為(wei)  DNA ，形成 DNA 整合前複合體(ti) ，進入細胞核後， DNA 整合到細胞基因組中。整合後的 DNA 轉錄 mRNA ，回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產(chan) 生 RNAi 幹擾。

    慢病毒載體(ti) 介導的基因表達或 RNAi 幹擾作用持續且穩定，原因是目的基因整合到宿主細胞基因組中，並隨細胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體(ti) 能有效感染並整合到非分裂細胞中。以上特性使慢病毒載體(ti) 與(yu) 其它病毒載體(ti) 相比，比如不整合的腺病毒載體(ti) 、整合率低的腺相關(guan) 病毒載體(ti) 、隻整合分裂細胞的傳(chuan) 統逆轉錄病毒載體(ti) ，有鮮明的特色。大量文獻研究表明，慢病毒載體(ti) 介導的目的基因長期表達的組織或細胞包括腦、肝髒、肌肉、視網膜、造血幹細胞、骨髓間充質幹細胞、巨噬細胞等。

    慢病毒載體(ti) 不表達任何 HIV-1 蛋白，免疫原性低，在注射部位無細胞免疫反應，體(ti) 液免疫反應也較低，不影響病毒載體(ti) 的第 2 次注射。

 

1. 構建原理

   慢病毒屬於(yu) 逆轉錄病毒科，但其基因組結構複雜，除 gag、pol 和 env 這 3 個(ge) 和單純逆轉錄病毒相似的結構基因外，還包括 4 個(ge) 輔助基因，vif、vpr、nef、vpu 和 2 個(ge) 調節基因 tat 和 rev 。 HIV 21 是慢病毒中特征性的病毒，*個(ge) 慢病毒載體(ti) 係統即以此病毒為(wei) 基礎進行構建的。慢病毒載體(ti) 的構建原理就是將 HIV 21 基因組中的順式作用元件 （ 如包裝信號、長末端重複序列 ） 和編碼反式作用蛋白的序列進行分離。載體(ti) 係統包括包裝成分和載體(ti) 成分：包裝成分由 HIV 21 基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能反式提供產(chan) 生病毒顆粒所需的蛋白；載體(ti) 成分與(yu) 包裝成分互補，含有包裝、逆轉錄和整合所需的 HIV 21順式作用序列。

    同時具有異源啟動子控製下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。為(wei) 降低兩(liang) 種成分同源重組產(chan) 生有複製能力的病毒 （RCV ） 的可能性，將包裝成分的 5 ′ LTR 換成巨細胞病毒 （CMV ） 立即早期啟動子，3 ′ LTR 換成 SV 40 polyA 位點等。將包裝成分分別構建在兩(liang) 個(ge) 質粒上，即一個(ge) 表達 gag 和 pol、另一個(ge) 表達 env 。根據這個(ge) 原理，Naldini 和 Kafri 等構建了三質粒表達係統。

2. 三質粒表達係統

    三質粒表達係統包括包裝質粒、包膜蛋白質粒和轉移質粒。其中包裝質粒在 CMV 啟動子的控製下，表達 HIV 21 複製所需的全部反式激活蛋白，但不產(chan) 生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu；包膜蛋白質粒編碼水泡性口炎病毒 G 蛋白 （V SV 2G），應用 VSV 2G 包膜的假構型慢病毒載體(ti) 擴大了載體(ti) 的靶細胞嗜性範圍，而且增加了載體(ti) 的穩定性，允許通過高速離心對載體(ti) 進行濃縮，提高了滴度； 轉移質粒中除含有包裝、逆轉錄及整合所需的順式序列，還保留 350 bp 的 gag 和 RRE，並在其中插入目的基因或標誌基因 （ 綠色熒光蛋白 GFP） 。將載體(ti) 係統分成三個(ge) 質粒zui大的益處是使序列重疊的機會(hui) 大大減少，減少載體(ti) 重組過程中產(chan) 生 RCV 的可能性。通過三質粒共轉染 293T 細胞，超速離心後病毒滴度可達 109IU /m l 。

3. 四質粒表達係統

    為(wei) 了減少 HIV 21 包裝結構的序列同源性，進一步減少重組成 RCV 的可能性，Dull 等人將輔助基因去除。但由於(yu)  gag2pol 的轉運需要 rev，因此，在上述的三質粒係統的基礎上，構建成四質粒表達係統，該係統加上含 rev 的質粒減少了產(chan) 生 RCV 的可能性，而且對非分裂期細胞轉導效率無影響。

 

1. 將目的基因 /RNAi 基因轉入難以轉染的細胞，比如神經元細胞、幹細胞或其它原代細胞；

2. 將目的基因 /RNAi 基因轉入動物組織，以期獲得長期表達；

3. 構建穩定表達目的蛋白 /RNAi 的細胞係，再用exvivo的方法導入動物體(ti) 內(nei) ；

4. 基因治療；

5. 轉基因動物；

6. 基因敲除；

7. 藥物研究：構建表達受體(ti) 蛋白的細胞係，研究藥物的作用；

8. 快速建立生產(chan) 目的蛋白的細胞係，非常有前途的真核細胞表達方法。

 

    慢病毒（ Lentivirus ）載體(ti) 是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 I 型病毒）為(wei) 基礎發展起來的基因治療載體(ti) 。區別一般的逆轉錄病毒載體(ti) ，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體(ti) 的研究發展得很快，研究的也非常深入。該載體(ti) 可以將外源基因有效地整合到宿主染色體(ti) 上，從(cong) 而達到持久性表達。在感染能力方麵可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nei) 皮細胞、幹細胞等多種類型的細胞，從(cong) 而達到良好的的基因治療效果，在美國已經開展了臨(lin) 床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。