慢病毒包裝概述及步驟

    目前慢病毒也被廣泛地應用於(yu) 表達 RNAi 的研究中。

    由於(yu) 有些類型細胞脂質體(ti) 轉染效果差，轉移到細胞內(nei) 的 siRNA 半衰期短，體(ti) 外合成 siRNA 對基因表達的抑製作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限製。采用事先在體(ti) 外構建能夠表達 siRNA 的載體(ti) ，然後轉移到細胞內(nei) 轉錄 siRNA 的策略，不但使脂質體(ti) 有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑製效果也不遜色於(yu) 體(ti) 外合成 siRNA ，在長期穩定表達載體(ti) 的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用。在所構建的 siRNA 表達載體(ti) 中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ啟動子來指導 RNA 合成的，這是因為(wei)  RNA 聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的 RNA 不會(hui) 帶 poly A 尾。當 RNA 聚合酶Ⅲ遇到連續 4 個(ge) 或 5 個(ge)  T 時，它指導的轉錄就會(hui) 停止，在轉錄產(chan) 物 3' 端形成 1~4 個(ge) U 。 U6 和 H1 RNA 啟動子是兩(liang) 種 RNA 聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位於(yu) 轉錄區的上遊，適合於(yu) 表達～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 莖環結構（ stem loop ）。在 siRNA 表達載體(ti) 中，構成 siRNA 的正義(yi) 與(yu) 反義(yi) 鏈，可由各自的啟動子分別轉錄，然後兩(liang) 條鏈互補結合形成 siRNA ；也可由載體(ti) 直接表達小發卡狀 RNA（small hairpin RNA, shRNA），載體(ti) 包含位於(yu)  RNA 聚合酶Ⅲ啟動子和 4 ～ 5 T轉錄終止位點之間的莖環結構序列，轉錄後即可折疊成具有 1~4 個(ge)  U 3 ' 突出端的莖環結構，在細胞內(nei) 進一步加工成 siRNA 。構建載體(ti) 前通常要通過合成 siRNA 的方法，尋找的 siRNA ，然後從(cong) 中挑選符合載體(ti) 要求的序列，將其引入 siRNA 表達載體(ti) 。

     慢病毒載體(ti) （ Lentiviral vector ）較逆轉錄病毒載體(ti) 有更廣的宿主範圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲(si) 分裂後的細胞。慢病毒載體(ti) 能夠產(chan) 生表達 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、幹細胞、受精卵以及分化的後代細胞中表達 shRNA ，實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默，為(wei) 在原代的人和動物細胞組織中快速而地研究基因功能，以及產(chan) 生特定基因表達降低的動物提供了可能性。

     慢病毒表達載體(ti) 包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳(chuan) 信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄並包裝 RNA 到重組的假病毒載體(ti) 所需要的所有輔助蛋白。為(wei) 產(chan) 生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體(ti) 和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yang) 基中，離心取得上清液後，可以直接用於(yu) 宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之後，經過反轉錄，整合到基因組，從(cong) 而高水平的表達效應分子。



 

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1. 對於(yu) 一些較難轉染的細胞，如原代細胞、幹細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，這就為(wei)  RNAi，cDNA 克隆以及報告基因的研究提供了一個(ge) 有利的途徑。

2. 進行穩轉細胞株的篩選；

3. 為(wei) 活體(ti) 動物模型實驗提供高質量的包含目的基因的病毒液；

在細胞相關(guan) 的實驗操作中，對於(yu) 一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞，通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率，以達到目的基因的瞬時表達。

 

     以六孔板中的1孔為(wei) 例，每個(ge) 樣品需要1×106個(ge) 293T細胞。


     1、取1.5ml滅菌EP管，加入1.5μg包裝混合質粒和0.5μg表達質粒以及250μl的無血清培養(yang) 基。輕柔混勻，室溫孵育5min。


     2、取1.5ml滅菌EP管，取9μl 脂質體(ti) 2000l溶於(yu) 250μl無血清培養(yang) 基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。

     3、將DNA溶液和脂質體(ti) 溶液輕柔混勻。室溫孵育20min

     4、用胰酶消化並記數293T細胞。用含血清的培養(yang) 基重懸細胞。

     5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長培養(yang) 基，再加入DNA-脂質體(ti) 複合物。

     6、將1ml重懸的293T細胞（1×106個(ge) 細胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育一晚。

     7、移除含有DNA-脂質體(ti) 複合物的培養(yang) 基移除，代之以DMEM（含丙酮酸鈉和非必須氨基酸）。

     8、轉染後48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉澱。

     9、病毒上清-80°C貯存。

     包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率。

注意事項：

      1.在慢病毒感染細胞前，為(wei) 檢測病毒上清培養(yang) 液內(nei) 病毒的活性，並確定病毒與(yu) 轉染細胞之間的比率，需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過轉染Hela細胞，然後使用抗體(ti) 篩選穩定的細胞轉染株，進行計數和數值統計。

      2. 在慢病毒轉染細胞的過程中zui重要的一步是融合，隻有一些較小的慢病毒載體(ti) 才能轉導進細胞，因此，病毒顆粒的吸附是慢病毒轉染的限速步驟。