簡述DNA甲基化檢測

    是哺乳類動物一個(ge) 重要的基因外遺傳(chuan) 信號。有研究表明,DNA甲基化與(yu) 大多數腫瘤的發生相關(guan) ,抑癌基因啟動子CpG島的高度甲基化可引起抑癌基因表達沉默，細胞出現無節製生長,導致腫瘤的發生。目前，基因的甲基化研究主要結合亞(ya) 硫酸氫鈉處理和PCR技術，分為(wei) 甲基化特異性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化測序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。 

 

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     雙鏈DNA變性解鏈後，在HSO3-作用下發生C→U轉化，C若已有甲基化則無此改變；甲基化修飾隻發生於(yu) 5′→3′方向C-G相聯結構的C上，因此在HSO3-作用後，DNA CpG島若無甲基化，則序列中的改變為(wei) C→U，CG→UG，若有甲基化則為(wei) C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可檢測出這種差異，從(cong) 而確定基因有無CpG島甲基化。從(cong) 理論上說，DNA發生甲基化的MSP產(chan) 物的序列與(yu) 原序列比較，變化為(wei) C→T，CG→CG，相應其互補鏈的改變為(wei) G→A，CG→CG。然後設計針對甲基化和非甲基化序列的引物並進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，zui後通過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與(yu) 引物互補的DNA序列的甲基化狀態。MSP法靈敏度較高，應用範圍廣。

 

    結合重亞(ya) 硫酸鹽的測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞(ya) 硫酸鹽處理後，用針對改變後的DNA序列設計特異性引物並進行聚合酶鏈式反應（PCR）。 PCR產(chan) 物中原先非甲基化的胞嘧啶位點被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位點保持不變。PCR產(chan) 物克隆後進行測序。通過這個(ge) 方法能得到特定位點在各個(ge) 基因組DNA分子中的甲基化狀態。

 

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1）   根據目的基因啟動子序列設計相應引物；
2）   基因組DNA的提取和定量；
3）   亞(ya) 硫酸氫鈉修飾基因組DNA；
4）   修飾後DNA純化回收；
5）   a、結合實時定量PCR的qMSP；
        b、BSP，對PCR產(chan) 物進行測序並與(yu) 未經處理的序列比較；
6）   數據處理；
7）   向客戶提交數據分析結果與(yu) 實驗報告。

 

樣品要求：

    盡可能新鮮和足量的組織（≥50mg）、細胞樣品（≥106）或全血（≥300μl），或直接提供純化好的DNA（≥5μg/樣品）。

 

    甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環的五號碳原子上加上甲基的共價(jia) 修飾過程.

    DNA甲基化是表觀遺傳(chuan) 修飾的主要方式，它不改變DNA的一級結構，卻在細胞的發育、基因的表達、及基因組的穩定性中起著重要的作用。

    CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現象，而啟動子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機製。

    因此，基因啟動子甲基化檢測在臨(lin) 床診斷（如甲基化檢測與(yu) 低劑量CT相結合）、藥物敏感性檢測等方麵具有很高的應用價(jia) 值。

    目前甲基化特異性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）及其改進方法是檢測基因甲基化的經典方法．MSP法的原理是首先用亞(ya) 硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶都被轉化為(wei) 尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不變。然後設計針對甲基化和非甲基化序列的引物並進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，zui後通過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與(yu) 引物互補的DNA序列的甲基化狀態。