siRNA幹擾載體構建與引物設計

 

siRNA幹擾載體(ti) 構建與(yu) 引物設計

 

siRNA幹擾載體(ti) 構建過程中，針對siRNA設計的引物是怎麽(me) 設計的?

一般是合成一對引物，然後退火，再與(yu) 線性化的載體(ti) 做連接。由於(yu) 引物比較長，所以合成時一般都會(hui) 有比較多的堿基突變，因此，做shRNA表達載體(ti) 構建的主要難度，在於(yu) 篩選出正確的克隆，有時候可能要選很多個(ge) 克隆測序才能篩到想要的。具體(ti) 的序列組成，一般是sense-loop-antisense。不同的公司會(hui) 有不同的設計原則的。

經驗：我們(men) 一般不去考慮構建載體(ti) 來得到siRNA！
載體(ti) 表達siRNA方法主要存在以下缺點：
1、外源導入shRNA的表達會(hui) 幹擾細胞本身miRNA的正常表達，而miRNA在基因的表達調控方麵有著至關(guan) 重要的作用，目前已經證實很多疾病的產(chan) 生通miRNA的表達異常存在確切關(guan) 係，已有很多文獻報道和證實；
2、載體(ti) 構建的周期長，操作較為(wei) 複雜，試驗重複性不好，做過的人應該大多都知道；
3、載體(ti) 用於(yu) 體(ti) 內(nei) 試驗的毒性非常大，容易激發機體(ti) 強烈的免疫應答反應，副作用大，已有多篇文獻證實；
4、通量低，影響因素更多，體(ti) 內(nei) 試驗的效果很差，存在安全性的問題；
5、shRNA的表達在時間和表達量上都較難控製等。
這也是為(wei) 什麽(me) 現在10多種進入臨(lin) 床試驗的RNAi藥物幾乎都是用化學合成的siRNA來做的原因！