目的基因亞克隆

亞(ya) 克隆

已經獲得的目的DNA條帶進行重新克隆，其目的在於(yu) 對目的DNA進行進一步分析，或者進行重組改造等。

亞(ya) 克隆的基本過程包括：

（1）目的DNA條帶和載體(ti) 的製備；（2）目的DNA條帶和載體(ti) 的連接；（3）連接產(chan) 物的轉化；（4）重組子篩選。

目的DNA條帶和載體(ti) 的製備
    選擇適宜的限製性核酸內(nei) 切酶，消化已知目的DNA和載體(ti) ，獲得線性DNA，用於(yu) 重組。根據目的DNA和載體(ti) 的具體(ti) 情況，選擇一種或者兩(liang) 種適當的限製酶切割，分別產(chan) 生對稱性粘性末端（用一種限製性內(nei) 切酶進行消化而產(chan) 生帶有互補突出端）、不對稱粘性末端（用兩(liang) 種不同的限製性內(nei) 切酶進行消化而產(chan) 生帶有非互補突出端）、平端。在亞(ya) 克隆時，*不對稱相容末端連接，次選對稱性粘性相容性末端連接，由於(yu) 平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時目的片段的末端與(yu) 載體(ti) 不匹配 ，一般先將不匹配末端補平，然後再以平末端連接。

利用T4 DNA連接酶進行目的DNA條帶和載體(ti) 的體(ti) 外連接

連接產(chan) 物的轉化
⑴ 取100μl貯存於(yu) -70℃鈣化菌，冰浴化開；
⑵ 加入適量連接產(chan) 物（一般不超過10μl，輕輕混勻，冰浴20min；
⑶ 於(yu) 42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴中，繼續冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液體(ti) 培養(yang) 基200μl，於(yu) 37℃緩搖孵育45min；
⑸ 將培養(yang) 物適量塗於(yu) 1.5%瓊脂LB平板（根據質粒性質添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待膠表麵沒有液體(ti) 流動時，37℃溫箱倒置培養(yang) 12-16hr。

重組子的篩選
   根據載體(ti) 的遺傳(chuan) 特征篩選重組子，如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體(ti) 都帶有一個(ge) 大腸杆菌的DNA的短區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個(ge) 氨基酸的編碼信息。在這個(ge) 編碼區中插入了一個(ge) 多克隆位點（MCS），它並不破壞讀框，但可使少數幾個(ge) 氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體(ti) 適用於(yu) 可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們(men) 同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與(yu) 帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為(wei) α-互補。由α-互補而產(chan) 生的LacZ 細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產(chan) 生藍色菌落，因而易於(yu) 識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為(wei) 藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產(chan) 物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yang) 12-16hr後，有重組質粒的細菌形成白色菌落。