TA克隆

TA克隆實驗原理　

  TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉移酶活性，而不具有3 一5外切酶的校準活性，即在PCR產(chan) 物的兩(liang) 個(ge) 3 末端加上未配對的單一A凸出尾 ，質粒載體(ti) 提供線性3末端單一的T凸出尾，使該載體(ti) 能夠直接與(yu) PCR產(chan) 物高效連接。技術比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

隻需4個(ge) 步驟：①擴增目的PCR產(chan) 物；②製備T克隆載體(ti) ；③PCR產(chan) 物直接克隆至T載體(ti) 上④轉化並篩選重組子。

實驗步驟

（1）擴增後的PCR產(chan) 物與(yu) T載體(ti) 的連接

取1隻無菌Ep管、用微量進樣器按下列順序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

PCR產(chan) 物約0.3 pmol

T載體(ti) 約0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至 25ul

*1 DNA的摩爾數應控製在載體(ti) DNA摩爾數的3－10倍。

*2 相同末端的載體(ti) 與(yu) DNA進行連接時，應首先將載體(ti) 進行去磷酸化處理，以防止其自身環化。

（2）蓋好蓋子，用手指輕彈Ep管數次，並於(yu) 台式離心機離心2s 以集中溶液。

（3）將反應管放入4℃金屬浴中反應20h。

（4）取出約2ul的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定連接結果，與(yu) 未經連接的質粒DNA和酶切DNA一同作電泳。

（5）用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul，使用10ul轉化大腸杆菌感受態細胞。

（6）通過Amp抗性來篩選轉化子，轉化子擴增後，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。